zldmЗаводская лаборатория. Диагностика материаловIndustrial laboratory. Diagnostics of materials1028-68612588-0187ООО «Издательство «ТЕСТ-ЗЛ»10.26896/1028-6861-2020-86-2-15-22zldm-1154Research ArticleАНАЛИЗ ВЕЩЕСТВАSUBSTANCES ANALYSISМетодические особенности спектрофотометрического определения белков в биологических жидкостях по реакции с бромпирогаллоловым краснымMethodological features of the spectrophotometric determination of proteins in biological fluids using reactions with brompyrogallol redПочинокТ. Б.PochinokT. B.

Татьяна Борисовна Починок

350040, Краснодар, ул. Ставропольская, д. 149

Taniana B. Pochinok

149, Stavropol’skaya st., Krasnodar, 350040

pochinokt@chem.kubsu.ruАнисимовичП. В.AnisimovichP. V.

Полина Владимировна Анисимович

350040, Краснодар, ул. Ставропольская, д. 149

Polina V. Anisimovich

149, Stavropol’skaya st., Krasnodar, 350040

ТемердашевЗ. А.TemerdashevZ. A.

Зауаль Ахлоович Темердашев

350040, Краснодар, ул. Ставропольская, д. 149

Zaual A. Temerdashev

149, Stavropol’skaya st., Krasnodar, 350040

Кубанский государственный университетРоссияKuban State UniversityRussian Federation2020270220208621522Copyright © Починок Т.Б., Анисимович П.В., Темердашев З.А., 20202020Починок Т.Б., Анисимович П.В., Темердашев З.А.Pochinok T.B., Anisimovich P.V., Temerdashev Z.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.zldm.ru/jour/article/view/1154

При проведении диагностических исследований результаты определения общего белка в биологических жидкостях зависят от аминокислотного состава присутствующих в них белков. В работе обсуждены некоторые аспекты спектрофотометрического определения белков в биологических жидкостях, в частности, особенности методики, основанной на реакции белков с бромпирогаллоловым красным (БПГК), важнейшим преимуществом которого является высокая и одинаковая чувствительность красителя к белкам альбуминовой и глобулиновой фракций. Это позволяет минимизировать погрешности, возникающие за счет несовпадения белкового состава анализируемых проб и используемых градуировочных растворов. Цель работы — исследование влияния условий и сроков хранения раствора БПГК на его аналитические свойства при спектрофотометрическом определении белков в биологических жидкостях. Стабильность оптических и аналитических свойств растворов реагента изучена с использованием критериев Фишера и Стьюдента при различных температурах хранения растворов, содержащих в качестве стабилизатора этанол или бензоат натрия. Проверку правильности определения общего белка по предложенной методике проводили методом «введено – найдено», вводя добавки стандартных растворов, приготовленных из калибраторов «Общий белок» или «Альбумин». Разработанная методика спектрофотометрического определения белков в моче по реакции с бромпирогаллоловым красным апробирована при анализе реальных объектов, метрологически аттестована и внесена в Федеральный реестр аттестованных методик выполнения измерений. Проведенные аналитические и метрологические исследования показали, что методика определения белков с использованием реагента на основе БПГК позволяет определять белки альбуминовой и глобулиновой фракций в биологических жидкостях человека с высокой и одинаковой чувствительностью. Для увеличения сроков хранения раствора реагента и сохранения его аналитических свойств рекомендуется использовать этанол в качестве стабилизатора.

Determination of proteins in biological fluids is rather important for diagnostics in current clinical practice. The results of total protein determination depend on the amino-acid composition of the proteins present in the biological fluid. We discuss some aspects of the spectrophotometric determination of proteins in biological fluids, in particular, the methodological features of the technique based on the reaction of proteins with brompyrogallol red (BPGR). The most important advantage of BPGR in the determination of proteins in biological fluids is rather high and equal sensitivity of the dye to the proteins of albumin and globulin fractions, thus minimizing the errors attributed to the mismatch of the protein composition of the analyzed samples and calibration solutions used. The goal of the work is to study the impact of conditions and shelf life of the BPGR solution on the analytical properties of the solution in the spectrophotometric determination of proteins in biological fluids. Stability of the optical and analytical properties of BPGR solutions are studied using Fisher and Student criteria under conditions of different storage temperatures and nature of the stabilizer (ethanol or sodium benzoate) in the reagent solutions. Verification of the correctness of the total protein determination by the proposed method was carried out in spike tests. The introduced additives of standard solutions are prepared from the «Total protein» or «Albumin» calibrators. The developed method of the spectrophotometric determination of the mass concentration of proteins in the urine by the reaction with bromopyrogallol red was tested on real objects, metrologically certified and listed in the Federal register of certified measurement techniques. Analytical and metrological studies have shown that the developed method of protein determination with a reagent based on BPGR provides equal and high sensitivity of determination of albumin and globulin protein fractions in human biological fluids. To increase the shelf life of the reagent solution and preserve the analytical properties of the solution, we recommend to use ethanol as a stabilizer.

общий белокальбуминглобулиныспектрофотометрический методбромпирогаллоловый красныйбиологические жидкостиReferencesSchleicher E., Wieland O. H. Evaluation of the Bradford method for protein determination in body fluids / J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1978. Vol. 16. N 9. P. 533 – 534.Schleicher E., Wieland O. H. Evaluation of the Bradford method for protein determination in body fluids / J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1978. Vol. 16. N 9. P. 533 – 534.Marshall T., Williams K. M. Total protein determination in urine: elimination of a differential response between the coomassie blue and pyrogallol red protein dye-binding assays / Clin. Chem. 2000. Vol. 46. N 3. P. 392 – 398.Marshall T., Williams K. M. Total protein determination in urine: elimination of a differential response between the coomassie blue and pyrogallol red protein dye-binding assays / Clin. Chem. 2000. Vol. 46. N 3. P. 392 – 398.Samudra P. B., Swagata P., Shakuntala G., et al. Interference of sugars in the Coomassie Blue G dye binding assay of proteins / Anal. Biochem. 2009. Vol. 386. N 1. P. 113 – 115. DOI: 10.1016/j.ab.2008.12.006.Samudra P. B., Swagata P., Shakuntala G., et al. Interference of sugars in the Coomassie Blue G dye binding assay of proteins / Anal. Biochem. 2009. Vol. 386. N 1. P. 113 – 115. DOI: 10.1016/j.ab.2008.12.006.Trivedi V. D. On the role of lysine residues in the bromophenol blue — Albumin interaction / Ital. J. Biochem. 1997. Vol. 46. N 2. P. 67 – 73.Trivedi V. D. On the role of lysine residues in the bromophenol blue — Albumin interaction / Ital. J. Biochem. 1997. Vol. 46. N 2. P. 67 – 73.Vatassery G. T., Krezowski A. M., Sheridan M. A. Comparison of manual methods of determination of albumin in human cerebrospinal fluid by the bromcresol green and immuno-precipitation methods / Clin. Biochem. 1980. Vol. 13. N 2. P. 78 – 80. DOI: 10.1016/S0009-9120(80)91233-3.Vatassery G. T., Krezowski A. M., Sheridan M. A. Comparison of manual methods of determination of albumin in human cerebrospinal fluid by the bromcresol green and immuno-precipitation methods / Clin. Biochem. 1980. Vol. 13. N 2. P. 78 – 80. DOI: 10.1016/S0009-9120(80)91233-3.Yalamati P., Bhongir A. V., Karra M., Beedu S. R. Comparative Analysis of Urinary Total Proteins by Bicinchoninic Acid and Pyrogallol Red Molybdate Methods / J. Clin. Diagn. Res. 2015. Vol. 9. N 8. P. 1 – 4. DOI: 10.7860/JCDR/2015/13543.6313.Yalamati P., Bhongir A. V., Karra M., Beedu S. R. Comparative Analysis of Urinary Total Proteins by Bicinchoninic Acid and Pyrogallol Red Molybdate Methods / J. Clin. Diagn. Res. 2015. Vol. 9. N 8. P. 1 – 4. DOI: 10.7860/JCDR/2015/13543.6313.Ларичева Е. С., Андреев Ю. Н., Козлов А. В. Способен ли метод определения белка в моче пирогаллоловым красным претендовать на роль основного / Лабораторная диагностика. 2009. № 1. С. 24 – 32.Laricheva E., Andreev J., Kozlov A. If a method of determining protein in the urine pyrogallol red to claim the role of principal / Klin. Lab. Diagn. 2009. N 1. P. 24 – 32 [in Russian].Williams K. M., Marshall T. Protein concentration of cerebrospinal fluid by precipitation with Pyrogallol Red prior to sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis / J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. Vol. 47. N 3. P. 197 – 207. DOI: 10.1016/S0165-022X(00)00135-4.Williams K. M., Marshall T. Protein concentration of cerebrospinal fluid by precipitation with Pyrogallol Red prior to sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis / J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. Vol. 47. N 3. P. 197 – 207. DOI: 10.1016/S0165-022X(00)00135-4.Lynch K. M., Sellers T. S., Gossett K. A. Evaluation of an automted pyrogallol red-molybdate method for the measurement of urinary protein in rats / Eur. J. Clin. Chem. Clin Biochem. 1996. Vol. 34. N 7. P. 569 – 571.Lynch K. M., Sellers T. S., Gossett K. A. Evaluation of an automted pyrogallol red-molybdate method for the measurement of urinary protein in rats / Eur. J. Clin. Chem. Clin Biochem. 1996. Vol. 34. N 7. P. 569 – 571.Пупкова В. И., Прасолова Л. М. Метод с пирогаллоловым красным — альтернатива традиционным методам определения белка в моче / Клин. лаб. диагностика. 2007. № 6. С. 17 – 21.Pupkova V. I., Prasolova L. M. The method with pyrogallol red — an alternative to the traditional methods of determining protein in the urine / Klin. Lab. Diagn. 2007. N 6. P. 17 – 21 [in Russian].Marshall T., Williams K. M. Interference in the Coomassie Brilliant Blue and Pyrogallol Red protein dye-binding assays is increased by the addition of sodium dodecyl sulfate to the dye reagents / Anal Biochem. 2004. Vol. 331. N 2. P. 255 – 259. DOI: 10.1016/j.ab.2004.04.029.Marshall T., Williams K. M. Interference in the Coomassie Brilliant Blue and Pyrogallol Red protein dye-binding assays is increased by the addition of sodium dodecyl sulfate to the dye reagents / Anal Biochem. 2004. Vol. 331. N 2. P. 255 – 259. DOI: 10.1016/j.ab.2004.04.029.Da Silva A. S., Falkenberg M. Analytical interference of quinolone antibiotics and quinine derived drugs on urinary protein determined by reagent strips and the pyrogallol red-molybdate protein assay / Clin. Biochem. 2011. Vol. 44. N 12. P. 1000 – 1004. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2011.05.018.Da Silva A. S., Falkenberg M. Analytical interference of quinolone antibiotics and quinine derived drugs on urinary protein determined by reagent strips and the pyrogallol red-molybdate protein assay / Clin. Biochem. 2011. Vol. 44. N 12. P. 1000 – 1004. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2011.05.018.Yanga Jui-Yi., Chiena Tzu-I., Lua Jin-Ying, Kaoa Jau-Tsuen. Heparin interference in the cerebrospinal fluid protein assay measured with a pyrogallol red-molybdate complex / Clin. Chim. Acta. 2009. Vol. 408. N 1 – 2. P. 75 – 78. DOI: 10.1016/j.cca.2009.07.011.Yanga Jui-Yi., Chiena Tzu-I., Lua Jin-Ying, Kaoa Jau-Tsuen. Heparin interference in the cerebrospinal fluid protein assay measured with a pyrogallol red-molybdate complex / Clin. Chim. Acta. 2009. Vol. 408. N 1 – 2. P. 75 – 78. DOI: 10.1016/j.cca.2009.07.011.Fujita Y., Mori I., Kitano S. Color reaction between Pyrogallol Red — molybdenium(VI) complex and protein / J. Bunseki Kagaku. 1983. Vol. 32. P. 379 – 386. DOI: 10.2116/bunsekikagaku.32.12_E379.Fujita Y., Mori I., Kitano S. Color reaction between Pyrogallol Red — molybdenium(VI) complex and protein / J. Bunseki Kagaku. 1983. Vol. 32. P. 379 – 386. DOI: 10.2116/bunsekikagaku.32.12_E379.Orsonneau J. L., Douet P., Massoubre C., et al. An improved pyrogallol red-molybdate method for the determining total urinary protein / Clin. Chem. 1989. Vol. 35. P. 2233 – 2235.Orsonneau J. L., Douet P., Massoubre C., et al. An improved pyrogallol red-molybdate method for the determining total urinary protein / Clin. Chem. 1989. Vol. 35. P. 2233 – 2235.Watanabe N., Kamel S., Ohkubo A., et al. Urinary protein as measured with a pyrogallol-red-molybdate complex manually and in a Hitachi 726 automated analyzer / Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P. 1551 – 1154. DOI: 10.1371/journal.pone.0100768.Watanabe N., Kamel S., Ohkubo A., et al. Urinary protein as measured with a pyrogallol-red-molybdate complex manually and in a Hitachi 726 automated analyzer / Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P. 1551 – 1154. DOI: 10.1371/journal.pone.0100768.Lefevre G., Bloch S., Le Bricon T., Billier S., et al. Influence of protein composition on total urinary protein determined by pyrocatechol-violet (UPRO Vitros) and pyrogallol red dye binding methods / J. Clin. Lab. Anal. 2001. Vol. 15. N 1. P. 40 – 42. DOI: 10.1002/1098-2825(2001)15:1<40::AID-JCLA8>3.0.CO;2-0.Lefevre G., Bloch S., Le Bricon T., Billier S., et al. Influence of protein composition on total urinary protein determined by pyrocatechol-violet (UPRO Vitros) and pyrogallol red dye binding methods / J. Clin. Lab. Anal. 2001. Vol. 15. N 1. P. 40 – 42. DOI: 10.1002/1098-2825(2001)15:1<40::AID-JCLA8>3.0.CO;2-0.Marshall T., Williams K. M. Protein determination in cerebrospinal fluid by protein dye-binding assay / Brit. J. Biomed. Sci. 2000. Vol. 57. N 4. P. 281 – 286.Marshall T., Williams K. M. Protein determination in cerebrospinal fluid by protein dye-binding assay / Brit. J. Biomed. Sci. 2000. Vol. 57. N 4. P. 281 – 286.Artiss J. D., Thibert R. J., Zak B. Spectrophotometric study of total protein-albumin methods applied to cerebrospinal fluid / 1981. Clin. Biochem. Vol. 14. N 1. P. 32 – 38. DOI: 10.1016/0009-9120(81)90165-X.Artiss J. D., Thibert R. J., Zak B. Spectrophotometric study of total protein-albumin methods applied to cerebrospinal fluid / 1981. Clin. Biochem. Vol. 14. N 1. P. 32 – 38. DOI: 10.1016/0009-9120(81)90165-X.Миллер В. Г., Брунс Д. Е., Хортин Г. Л. и др. Современное состояние вопросов измерения и представления результатов выделения альбумина с мочой / Клин. лаб. диагностика. 2012. № 3. С. 43 – 53. DOI: 10.1373/clinchem.2008.106567.Miller V. G., Bruns D. E., Hortin G. L., et al. Current issues in measurement and reporting of urinary albumin excretion / Klin. Lab. Diagn. 2012. N 3. P. 43 – 53. DOI: 10.1373/clinchem.2008.106567 [in Russian].Dube J., Girouard J., Leclerc P., Douville P. Problems with the estimation of urine protein by automated assays / Clin. Biochem. 2005. Vol. 38. P. 479 – 485. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2004.12.010.Dube J., Girouard J., Leclerc P., Douville P. Problems with the estimation of urine protein by automated assays / Clin. Biochem. 2005. Vol. 38. P. 479 – 485. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2004.12.010.Negin S., Wayne F. P., Mark J. L., Shepro D. Pyrogallol Red — molybdate: A reversible, metal chelate stain for detection of proteins immobilized on membrane supports / Electrophoresis. 1996. Vol. 17. P. 678 – 693. DOI: 10.1002/elps.1150170411.Negin S., Wayne F. P., Mark J. L., Shepro D. Pyrogallol Red — molybdate: A reversible, metal chelate stain for detection of proteins immobilized on membrane supports / Electrophoresis. 1996. Vol. 17. P. 678 – 693. DOI: 10.1002/elps.1150170411.Анисимович П. В., Починок Т. Б., Токарева Е. В. Спектрофотометрическое определение белков в биологических жидкостях / Журн. аналит. химии. 2017. Т. 72. № 12. С. 1069 – 1077. DOI: 10.7868/S0044450217120039.Anisimovich P. V., Pochinok T. B., Tokareva E. V. Spectrophotometric determination of proteins in biological fluids / J. Anal. Chem. 2017. Vol. 72. N 12. P. 1212 – 11218. DOI: 10.1134/S1061934817120024.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.