zldmЗаводская лаборатория. Диагностика материаловIndustrial laboratory. Diagnostics of materials1028-68612588-0187ООО «Издательство «ТЕСТ-ЗЛ»10.26896/1028-6861-2023-89-3-14-24zldm-1883Research ArticleАНАЛИЗ ВЕЩЕСТВАSUBSTANCES ANALYSISИсследование влияния ускоренных электронов на структурные характеристики бычьего сывороточного альбумина с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешенияStudy of the effect of accelerated electrons on the structural characteristics of the bovine serum albumin using liquid chromatography-mass spectrometry and high-resolution tandem mass spectrometryБраунА. В.BrownA. V.

Аркадий Владимирович Браун

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3

Arkady V Brown

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-3

БлизнюкУ. А.BliznyukU. A.

Ульяна Александровна Близнюк

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2

Ulyana A. Bliznyuk

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-2

БорщеговскаяП. Ю.BorshchegovskayaP. Y.

Полина Юрьевна Борщеговская

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2

Polina Yu. Borshchegovskaya

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-2

ИпатоваВ. С.IpatovaV. S.

Виктория Сергеевна Ипатова

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2

Victoria S. Ipatova

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-2

ХмелевскийО. Ю.KhmelevskyO. Y.

Олег Юрьевич Хмелевский

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2

Oleg Yu. Khmelevsky

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-2

ЧерняевА. П.ChernyaevA. P.

Александр Петрович Черняев

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 2

Alexander P Chernyaev

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-2

АнаньеваИ. А.AnanyevaI. A.

Ирина Алексеевна Ананьева

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3

Irina A. Ananyeva

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-3

РодинИ. А.RodinI. A.

Игорь Александрович Родин

119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3119435, Москва, ул. Б. Пироговская, д. 2, стр. 2

Igor A. Rodin

119991, Moscow, Leninskie gory, 1-3119435, Moscow, B. Pirogovskaya ul., 2-2

igorrodin@yandex.ruХимический факультет Московского государственного университета имени М. В. ЛомоносоваРоссияFaculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State UniversityRussian FederationФизический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова; Научно-исследовательский институт ядерной физики имени Д. В. СкобельцынаРоссияFaculty of Physics, Lomonosov Moscow State University; Skobeltsyn Institute of Nuclear PhysicsRussian FederationНаучно-исследовательский институт ядерной физики имени Д. В. СкобельцынаРоссияSkobeltsyn Institute of Nuclear PhysicsRussian FederationФизический факультет Московского государственного университета имени М. В. ЛомоносоваРоссияFaculty of Physics, Lomonosov Moscow State UniversityRussian FederationФизический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова; ; Научно-исследовательский институт ядерной физики имени Д. В. СкобельцынаРоссияFaculty of Physics, Lomonosov Moscow State University; Skobeltsyn Institute of Nuclear PhysicsRussian FederationХимический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова; Первый МГМУ имени И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра эпидемиологии и доказательной медициныРоссияFaculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University; I. M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), Department of Epidemiology and Evidence-Based MedicineRussian Federation2023230320238931424Copyright © Браун А.В., Близнюк У.А., Борщеговская П.Ю., Ипатова В.С., Хмелевский О.Ю., Черняев А.П., Ананьева И.А., Родин И.А., 20232023Браун А.В., Близнюк У.А., Борщеговская П.Ю., Ипатова В.С., Хмелевский О.Ю., Черняев А.П., Ананьева И.А., Родин И.А.Brown A.V., Bliznyuk U.A., Borshchegovskaya P.Y., Ipatova V.S., Khmelevsky O.Y., Chernyaev A.P., Ananyeva I.A., Rodin I.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.zldm.ru/jour/article/view/1883

Предложен метод количественной оценки влияния дозы ионизирующего излучения на структурные характеристики бычьего сывороточного альбумина (БСА) в водном растворе путем идентификации уникальных пептидов доменных структур белка с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. БСА с начальной концентрацией 500 мг/л в физиологическом растворе облучали пучком ускоренных электронов с максимальной энергией 1 МэВ при среднем токе пучка 1 мкА, средняя мощность дозы составляла 18,5 Гр/с. Поглощенную дозу в объеме образца оценивали с помощью ферросульфатного дозиметра Фрикке. После облучения раствора БСА в дозах 0,3, 0,6, 1, 8 и 20 кГр проводили анализ структурной целостности нативной формы белка и количественную оценку его содержания. Для этого путем центрифугирования отделяли соединения с массой более 30 кДа, затем осуществляли ферментативный гидролиз БСА с добавлением раствора трипсина и повторно отделяли образовавшиеся пептиды с массой более 10 кДа. Полученные образцы анализировали методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЖЭХ-МС/МС). Далее оценивали содержание неповрежденных молекул белка путем определения концентраций уникальных пептидов, соответствующих каждому из трех доменов, на которые разделялась аминокислотная последовательность БСА. С использованием разработанного подхода установлено изменение естественной конформации исследуемого белка (его денатурация) в водных пробах в результате воздействия ионизирующего излучения в дозах 0,3 - 20 кГр: в среднем у 71 % белковых молекул при дозе облучения до 1 кГр, у 79 % молекул при дозе 4 кГр и 99 - 100 % молекул при дозах 8 и 20 кГр.

A method for quantification of the dose effect of ionizing radiation on the structural characteristics of bovine serum albumin (BSA) in aqueous solution through identification of unique peptides of protein domain structures using high-resolution liquid chromatography-mass spectrometry is proposed. BSA with the initial concentration of 500 mg/liter in a physiological solution was exposed to irradiation at a dose rate of 18. 5 Gy/sec using an accelerated electron beam with the maximum energy of 1 MeV at an average beam current of 1 uA. The absorbed dose in the sample volume was estimated using a Fricke (ferrous sulphate) dosimeter. After irradiation of BSA solution at 0.3, 0.6,1.8, and 20 kGy we analyzed the structural integrity of the protein native form and then quantified the content. For this, masses more than 30 kDa were removed using centrifugation. Then BSA was subjected to enzymatic hydrolysis with the addition of trypsin solution, and the resulting peptides with a mass of more than 10 kDa were repeatedly removed. The resultant samples were then examined using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) and high-resolution tandem mass spectrometry (HRMS-MS/MS). The content of intact protein molecules was assessed by determining the concentrations of unique peptides corresponding to each of the three domains into which the amino acid sequence of BSA was divided. Using the developed methodology, a change in the natural conformation of bovine serum albumin (denaturation) in water samples induced by ionizing radiation at a dose ranging from 0.3 to 20 kGy was revealed on average in 71% of protein molecules exposed to doses up to 1 kGy in 79% of molecules exposed to doses of 4 kGy and in 99 % to 100% of molecules exposed to doses of 8 and 20 kGy.

масс-спектрометрия высокого разрешениявысокоэффективная жидкостная хроматографияускоренные электронырадиационная обработкабычий сывороточный альбуминпептиды БСАтрипсинолиз белковhigh resolution tandem mass spectrometryhigh performance liquid chromatographyaccelerated electronsradiation processingbovine serum albuminBSA peptidestrypsinolysis of proteinsАвторы выражают благодарность сотрудникам отдела электромагнитных процессов и взаимодействия атомных ядер НИИЯФ МГУ им. Д. В. Скобельцына В. И. Шведунову и Д. С. Юрову за возможность проведения облучения образцов на ускорителе УЭЛР-1-25-Т-001. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 22-63-00075.ReferencesZhang Y., Dong L., Zhang J., et al. Adverse Effects of Thermal Food Processing on the Structural, Nutritional, and Biological Properties of Proteins / Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2021. Vol. 12. N1 . P 259-286. DOI:10.1146/annurev-food-062320-012215Zhang Y, Dong L., Zhang J., et al. Adverse Effects of Thermal Food Processing on the Structural, Nutritional, and Biological Properties of Proteins / Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2021. Vol. 12. N 1. E 259 - 286. DOI:10.1146/annurev-food-062320-012215Orlien V, Rinnan A. Processing Effects on Protein Structure and Physicochemical Properties / Foods. 2022. Vol. 11. N 11. P 1607 - 1610. DOI:10.3390/foodslllll607Orlien V, Rinnan A. Processing Effects on Protein Structure and Physicochemical Properties / Foods. 2022. Vol. 11. N 11. E 1607 - 1610. DOI:10.3390/foodslllll607Nowshad E, Islam M. N., Khan M. S. Concentration and formation behavior of naturally occurring formaldehyde in foods / Agric. Food Secur. 2018. Vol. 7. N 1. P 17 - 25. DOI:10.1186/s40066-018-0166-4Nowshad E, Islam M. N., Khan M. S. Concentration and formation behavior of naturally occurring formaldehyde in foods / Agric. Food Secur. 2018. Vol. 7. N 1. E 17 - 25. DOI:10.1186/s40066-018-0166-4Rachid C, Barone M. Chemicals in the Food Industry: Toxicologies! Concerns and Safe Use. 1<sup>st</sup> Edition. — Switzerland: Springer Internationa! Publishing, 2020. — 70 p. DOI:10.1007/978-3-030-42943-0Rachid C, Barone M. Chemicals in the Food Industry: Toxicological Concerns and Safe Use. 1s t Edition. — Switzerland: Springer International Publishing, 2020. — 70 p. DOI:10.1007/978-3-030-42943-0Тимаков а P. Т. Влияние ионизирующего излучения на биологическую ценность белков говядины / Пищевая промышленность. 2020. Т. 5. С. 13 - 18. DOI:10.24411/0235-2486-2020-10048Timakova R. T. Comparative characteristics of technological properties of radiation-treated meat raw materials / Pishch. Prom. 2020. Vol. 5. E 13 - 18 [in Russian]. DOI:10.24411/0235-2486-2020-10048Rozhko Т. V, Nemtseva Е. V, Gardt М. V, et al. Enzymatic Responses to Low-Intensity Radiation of Tritium / Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. N 22. P 8464 - 8478. DOI:10.3390/ijms21228464Rozhko T. V., Nemtseva E. V., Gardt M. V, et al. Enzymatic Responses to Low-Intensity Radiation of Tritium / Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. N 22. E 8464 - 8478. DOI:10.3390/ijms21228464Adibian M., Mami Y. Effect of Electron-Beam Irradiation on Enzyme Activities in Agaricus brunnescens / J. Pure Appl. Microbiol. 2018. Vol. 12. N 3. P 1435 - 1442. DOI:10.22207/jpam.12.3.46Adibian M., Mami Y. Effect of Electron-Beam Irradiation on Enzyme Activities in Agaricus brunnescens / J. Pure Appl. Microbiol. 2018. Vol. 12. N 3. E 1435 - 1442. DOI:10.22207/jpam.12.3.46Дриль А. А., Рождественская Л. PI. Повышение биологической ценности белка и увеличение сроков хранения полуфабриката из вешенки обыкновенной методом электронной стерилизации / Изв. вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9. № 3. С. 500 - 508. DOI:10.21285/2227-2925-2019-9-3-500-508Dril A. A., Rozhdestvenskaya L. N. Use of electron sterilization to increase the biological protein value and increase the shelf life of semi-finished oyster mushroom products / Izv Vuzov. Prikl. Khim. Biotekhnol. 2019. Vol. 9. N 3. E 500 - 508 [in Russian]. DOI:10.21285/2227-2925-2019-9-3-500-508Павлов А. Н., Чиж Т. В., Снегире в А. С. и др. Технологический процесс радиационной обработки пищевой продукции и дозиметрическое обеспечение / Радиационная гигиена. 2020. Т. 13. № 4. С. 40 - 50. DOI:10.21514/1998-426Х-2020-13-4-40-50Pavlov A. N., Chizh T. V, Snegirev A. S., et al. Technological process of food irradiation and dosimetric support / Radiats. Gigiena. 2020. Vol. 13. N 4. E 40 - 50 [in Russian]. DOI:10.21514/1998-426X-2020-13-4-40-50Giroux М., Lacroix М. Nutritional adequacy of irradiated meat — a review / Food Res. Int. 1998. Vol. 31. N 4. P 257 - 264. DOI:10.1016/S0963-9969(98)00092-1Giroux M., Lacroix M. Nutritional adequacy of irradiated meat — a review / Food Res. Int. 1998. Vol. 31. N 4. E 257 - 264. DOI:10.1016/S0963-9969(98)00092-1Zhao L., Zhang Y., Pan Z., et al. Effect of electron beam irradiation on quality and protein nutrition values of spicy yak jerky / LWT — Food. Sci. Technol. 2017. Vol. 87. N 7. P 1 - 7. DOI:10.1016/j!wt.2017.08.062Zhao L., Zhang Y., Pan Z., et al. Effect of electron beam irradiation on quality and protein nutrition values of spicy yak jerky / LWT — Food. Sci. Technol. 2017. Vol. 87. N 7. E 1 - 7. DOI:10.1016/j.lwt.2017.08.062Zarei H., Bahreinipour M., Eskandari K., et al. Spectroscopic study of gamma irradiation effect on the molecular structure of bovine serum albumin / Vacuum. 2016. Vol. 136. P 91 - 96. DOI:10.1016/j.vacuum.2016.11.029Zarei H., Bahreinipour M., Eskandari K., et al. Spectroscopic study of gamma irradiation effect on the molecular structure of bovine serum albumin / Vacuum. 2016. Vol. 136. E 91 - 96. DOI:10.1016/j.vacuum.2016.11.029Liu G., Liu J., Tu Z., et al. Investigation of conformation change of glycated ovalbumin obtained by Co-60 gamma-ray irradiation under drying treatment / Innovative Food Sci. Emerging Technol. 2018. Vol. 47. P 286 - 291. DOI:10.1016/j.ifset.2018.03.011Liu G., Liu J., Tu Z., et al. Investigation of conformation change of glycated ovalbumin obtained by Co-60 gamma-ray irradiation under drying treatment / Innovative Food Sci. Emerging Technol. 2018. Vol. 47. E 286 - 291. DOI:10.1016/j.ifset.2018.03.011Liu Y.-E, Oey I., Bremer P., et al. Modifying the Functional Properties of Egg Proteins Using Novel Processing Techniques: A Review / Compr. Rev. Food Sci. Food Saf 2019. Vol. 18. N 4. P 986 - 1002. DOI:10.1111/1541-4337.12464Liu Y.-E, Oey I., Bremer P., et al. Modifying the Functional Properties of Egg Proteins Using Novel Processing Techniques: A Review / Compr. Rev. Food Sci. Food Saf 2019. Vol. 18. N 4. E 986 - 1002. DOI:10.1111/1541-4337.12464Antosiewicz J. M., Shugar D. UV — Vis spectroscopy of tyrosine side-groups in studies of protein structure. Part 2: selected applications / Biophys. Rev. Vol. 8. N 2. P 163 - 177. DOI:10.1007/sl2551-016-0197-7Antosiewicz J. M., Shugar D. UV — Vis spectroscopy of tyrosine side-groups in studies of protein structure. Part 2: selected applications / Biophys. Rev. Vol. 8. N 2. E 163 - 177. DOI:10.1007Ы2551-016-0197-7Mihaljev Z., Jaksic S., Balos M. Z., et al. Comparison of the Kjeldahl method, Dumas method and NIR method for total nitrogen determination in meat and meat products / J. Agroaliment. Proc. Technol. 2015. Vol. 21. N 4. P 365 - 370.Mihaljev Z., Jaksic S., Balos M. Z., et al. Comparison of the Kjeldahl method, Dumas method and NIR method for total nitrogen determination in meat and meat products / J. Agroaliment. Proc. Technol. 2015. Vol. 21. N 4. E 365 - 370.Barth A. Infrared spectroscopy of proteins / Biochim. Biophys. Acta. 2007. Vol. 1767. N 9. P 1073 - 1110. DOI:10.1016/j.bbabio.2007.06.004Barth A. Infrared spectroscopy of proteins / Biochim. Biophys. Acta. 2007. Vol. 1767. N 9. E 1073 - 1110. DOI:10.1016/j.bbabio.2007.06.004Chang S. K. C, Zhang Y. Protein Analysis / Nielsen S. S. (ed.), Food Analysis. Food Science Text Series. — Springer, Cham. 2017. P 315-331. DOI:10.1007/978-3-319-45776-518Chang S. K. C, Zhang Y. Protein Analysis / Nielsen S. S. (ed.), Food Analysis. Food Science Text Series. — Springer, Cham. 2017. E 315-331. DOI:10.1007/978-3-319-45776-518Oshokoya O. O., Roach C. A., Jiji R. D. Quantification of protein secondary structure content by multivariate analysis of deep-ultraviolet resonance Raman and circular dichroism spectroscopies / Anal. Methods. 2014. Vol. 6. N 6. P 1691 - 1699. DOI:10.1039/c3ay42032aOshokoya O. O., Roach C. A., Jiji R. D. Quantification of protein secondary structure content by multivariate analysis of deep-ultraviolet resonance Raman and circular dichroism spectroscopies / Anal. Methods. 2014. Vol. 6. N 6. E 1691 - 1699. DOI:10.1039/c3ay42032aPelton J. Т., McLean L. R. Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure / Anal. Biochem. 2000. Vol. 277. N 2. P 167 - 176. DOI:10.1006/abio.1999.4320Pelton J. Т., McLean L. R. Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure / Anal. Biochem. 2000. Vol. 277. N 2. E 167 - 176. DOI:10.1006/abio.1999.4320Murray R. K., Granner D. K., Mayes E A., Rodwell V W. Harper's Illustrated Biochemistry. 26<sup>th</sup> edition. — The McGraw-Hill Companies, Inc., 2003. — 693 p.Murray R. K., Granner D. K., Mayes E A., Rodwell V W. Harper's Illustrated Biochemistry. 26<sup>th</sup> edition. — The McGraw-Hill Companies, Inc., 2003. — 693 p.Gonzalez V D., Gugliotta L. М., Giacomelli С. Е., Meira G. R. Latex of immunodiagnosis for detecting the Chagas disease: II. Chemical coupling of antigen Ag36 onto carboxylated latexes / J. Mater. Sci. Mater Med. 2008. Vol. 19. N 2. E 789 - 795. DOI:10.1007/sl0856-006-0041-xGonzalez V D., Gugliotta L. M., Giacomelli С. E., Meira G. R. Latex of immunodiagnosis for detecting the Chagas disease: II. Chemical coupling of antigen Ag36 onto carboxylated latexes / J. Mater. Sci. Mater Med. 2008. Vol. 19. N 2. E 789 - 795. DOI:10.1007/sl0856-006-0041-xDoumas В. Т., Bayse D. D., Carter R. J., et al. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation / Clin. Chem. 1981. Vol. 27. N 10. E 1642 - 1650. DOI:10.1093/clinchem/27.10.1642Doumas В. Т., Bayse D. D., Carter R. J., et al. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation / Clin. Chem. 1981. Vol. 27. N 10. P 1642 - 1650. DOI:10.1093/clinchem/27.10.1642Francis G. Albumin and mammalian cell culture: implications for biotechnology applications / Cytotechnology 2010. Vol. 62. N 1. E 1 - 16. DOI:10.1007Ы0616-010-9263-3Francis G. Albumin and mammalian cell culture: implications for biotechnology applications / Cytotechnology. 2010. Vol. 62. N 1. E 1 - 16. DOI:10.1007/sl0616-010-9263-3Huang B. X., Kim H. Y., Dass C. Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical cross-linking and mass spectrometry / J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. Vol. 15. N 8. E 1237 - 1247. DOI:10.1016/j.jasms.2004.05.004Huang B. X., Kim H. Y., Dass C. Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical cross-linking and mass spectrometry / J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. Vol. 15. N 8. E 1237 - 1247. DOI:10.1016/j.jasms.2004.05.004Bliznyuk U. A., Borchegovskaya P. Yu., Chernyaev A. P., et al. Dose-rate effect of low-energy electron beam irradiation on bacterial content in chilled turkey / IOP Conf. Sen: Earth Environ. Sci. 2021. Vol. 640. N 3.032006. DOI:10.1088/1755-1315/640/3/032006Bliznyuk U. A., Borchegovskaya P. Yu., Chernyaev A. P., et al. Dose-rate effect of low-energy electron beam irradiation on bacterial content in chilled turkey / IOP Conf. Sen: Earth Environ. Sci. 2021. Vol. 640. N 3.032006. DOI:10.1088/1755-1315/640/3/032006Крот В. И., Голубева E. H., Музык а Т. В., Степанова О. Ю. Химические методы дозиметрии. Ферросульфатный метод дозиметрии (дозиметр Фрике): метод, пособие к лаб. практикуму. — Минск: БЕУ, 2011. — 33 с.Krot V I., Golubeva E. N., Muzyka T. V, Stepanova O. Yu. Chemical methods of dosimetry. Ferrosulfate dosimetry method (Fricke dosimeter): manual for laboratory workshop. — Minsk: BSU, 2011. — 33 p. [in Russian].Swissprot. Swiss Institute of Bioinformatics: Geneva, Switzerland. https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02769/entry (дата обращения 17.01.2022).Swissprot. Swiss Institute of Bioinformatics: Geneva, Switzerland. https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02769/entry (accessed January 17, 2022).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.