zldmЗаводская лаборатория. Диагностика материаловIndustrial laboratory. Diagnostics of materials1028-68612588-0187ООО «Издательство «ТЕСТ-ЗЛ»10.26896/1028-6861-2024-90-8-20-28zldm-2269Research ArticleАНАЛИЗ ВЕЩЕСТВАSUBSTANCES ANALYSISОпределение ретинола пальмитата и токоферола ацетата в липидных микрокапсулах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированиемDetermination of retinol palmitate and tocopherol acetate in lipid microcapsules by HPLC/UVБеспаловаЕ. А.BespalovaElena A.

Елена Александровна Беспалова,

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2, стр. 18.

Elena A. Bespalova, 

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050;

2-18, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050.

lena.chursina.1996@mail.ruДорожкоЕ. В.DorozhkoElena V.

Елена Владимировна Дорожко,

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30.

Elena V. Dorozhko, 

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050.

ГурьевА. М.GuryevArtem M.

Артем Михайлович Гурьев,

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2, стр. 18.

Artem M. Guryev, 

 2-18, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050.

АлексееваМ. М.AlekseevaMaria M.

Мария Михайловна Алексеева,

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30.

Maria M. Alekseeva, 

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050

КривощековС. В.KrivoshchekovSergey V.

Сергей Владимирович Кривощеков,

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2, стр. 18.

Sergey V. Krivoshchekov, 

 2-18, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050.

Национальный исследовательский Томский политехнический университет; Центр внедрения технологий СибГМУ Минздрава РоссииРоссияNational Research Tomsk Polytechnic University; Technology Implementation Center of the Siberian State Medical University of the Ministry of Health of RussiaRussian FederationНациональный исследовательский Томский политехнический университетРоссияNational Research Tomsk Polytechnic UniversityRussian FederationЦентр внедрения технологий СибГМУ Минздрава РоссииРоссияTechnology Implementation Center of the Siberian State Medical University of the Ministry of Health of RussiaRussian Federation2024240820249082028Copyright © Беспалова Е.А., Дорожко Е.В., Гурьев А.М., Алексеева М.М., Кривощеков С.В., 20242024Беспалова Е.А., Дорожко Е.В., Гурьев А.М., Алексеева М.М., Кривощеков С.В.Bespalova E.A., Dorozhko E.V., Guryev A.M., Alekseeva M.M., Krivoshchekov S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.zldm.ru/jour/article/view/2269

Представлена методика пробоподготовки для определения токоферола ацетата (ТА) и ретинола пальмитата (РП) в липидных микрокапсулах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием (ВЭЖХ-УФ) в изократическом режиме элюирования. Методика включает растворение микрокапсул при нагревании, охлаждение раствора, центрифугирование, фильтрацию и хроматографирование в выбранных условиях. На основании спектрофотометрических измерений определена оптимальная длина волны детектирования 288 ± 2 нм, позволяющая осуществлять совместное определение РП и ТА. Рассмотрено влияние состава подвижной фазы (ПФ) на хроматографические параметры (время удерживания, площадь пика, разрешение, ширина пика, коэффициент асимметрии пика) для стандартных образцов ТА и РП: наилучшие значения указанных параметров обеспечивает использование подвижной фазы ацетонитрил-изопропиловый спирт-1,2-дихлорэтан в объемном отношении 55:40:5. Предложенная методика позволяет определять ТА в диапазоне содержаний от 0 до 5 % и РП — от 0 до 10 %. Правильность результатов определения жирорастворимых витаминов (ТА и РП) в липидных микрокапсулах подтверждена методом «введено – найдено». Степень извлечения компонентов при использовании предложенной пробоподготовки составила не менее 98,5 % для ТА и не менее 99,6 % для РП. Методика может быть рекомендована для определения жирорастворимых витаминов в лабораториях контроля качества фармацевтических, косметических и пищевых производств.

An original method for the quantitative determination of retinol palmitate (RP) and tocopherol acetate (TA) in lipid microcapsules using reverse-phase high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV) in isocratic elution mode is proposed. The method includes sample preparation of lipid microcapsules, HPLC separation of microcapsule components TA and RP, as well as metrological support for the quantitative determination of vitamins. Sample preparation of microcapsules included the following stages: dissolution of microcapsules by heating, cooling of the solution, centrifugation and filtration. The proposed sample preparation procedure provides the extraction degree no less than 98.5% for TA and 99.6% for RP, respectively. Optimal HPLC-UV chromatography conditions for isocratic elution were selected. The optimal wavelength of 288 ± 2 nm determined from spectrophotometric measurements provides the joint determination of RP and TA. The effect of mobile phase (MP) composition on chromatographic parameters (retention time, peak area, resolution, peak width, peak asymmetry coefficient) for standard TA and RP samples is considered. The best values for these parameters were determined from the peaks obtained when using the mobile phase acetonitrile: isopropyl alcohol: 1,2-dichloroethane (55:40:5). Calibration dependences of the peak areas on the concentration of TA from 0 to 5% and RP from 0 to 10% were constructed; the correlation coefficients were 0.9981 and 0.9976, respectively. The accuracy of the method for the quantitative determination of fat-soluble vitamins (TA and RP) in lipid microcapsules was assessed in spike recovery tests. The method can be recommended for quality control laboratories to determine the quantitative content of fat-soluble vitamins such as retinol palmitate and tocopherol acetate in the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

токоферола ацетатретинола пальмитатлипидные микрокапсулыВЭЖХ-УФопределениеtocopherol acetateretinol palmitatecosmetic microcapsulesHPLC-UVdeterminationРабота выполнена при финансовой поддержке Центра внедрения технологий СибГМУ на базе кафедры ИШПР Национального исследовательского Томского политехнического университета.ReferencesFigueiredo J. A., Silva C. R. P., Souza Oliveira M. F., et al. Microencapsulation by spray chilling in the food industry: Opportunities, challenges, and innovations / Trends Food Sci. Technol. 2022. Vol. 120. P. 274 – 287. DOI: 10.1016/j.tifs.2021.12.026Figueiredo J. A., Silva C. R. P., Souza Oliveira M. F., et al. Microencapsulation by spray chilling in the food industry: Opportunities, challenges, and innovations / Trends Food Sci. Technol. 2022. Vol. 120. P. 274 – 287. DOI: 10.1016/j.tifs.2021.12.026Dhakal S. P., He J. Microencapsulation of vitamins in food applications to prevent losses in processing and storage: A review / Food Res. Int. 2020. Vol. 16. P. 137 – 180. DOI: 10.1016/j.foodres.2020.109326Dhakal S. P., He J. Microencapsulation of vitamins in food applications to prevent losses in processing and storage: A review / Food Res. Int. 2020. Vol. 16. P. 137 – 180. DOI: 10.1016/j.foodres.2020.109326Jadoon S., Waseem A., Yaqoob M., Nabi A. Flow injection spectrophotometric determination of vitamin E in pharmaceuticals, milk powder and blood serum using potassium ferricyanide — Fe (III) detection system / Chinese Chem. Lett. 2010. Vol. 21. N 6. P. 712 – 715. DOI: 10.1016/j.cclet.2009.11.013Jadoon S., Waseem A., Yaqoob M., Nabi A. Flow injection spectrophotometric determination of vitamin E in pharmaceuticals, milk powder and blood serum using potassium ferricyanide — Fe (III) detection system / Chinese Chem. Lett. 2010. Vol. 21. N 6. P. 712 – 715. DOI: 10.1016/j.cclet.2009.11.013Qi F. F., Tao L. M., Dai Y. M., el al. Optimization and application of high-throughput supported liquid extraction for simultaneous determination of carotenoids and fat-soluble vitamins in serum / J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2021. Vol. 1173. 122672. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122672Qi F. F., Tao L. M., Dai Y. M., el al. Optimization and application of high-throughput supported liquid extraction for simultaneous determination of carotenoids and fat-soluble vitamins in serum / J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2021. Vol. 1173. 122672. DOI: 10.1016/j.jchromb.2021.122672Khan A., Khan M. I., Iqbal Z., et al. An optimized and validated RP-HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-trans-Retinol (Vitamin A) and α-Tocopherol (Vitamin E) in human serum: Comparison of different particulate reversed-phase HPLC columns / J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2010. Vol. 878. N 25. P. 2339 – 2347. DOI: 10.1016/j.jchromb.2010.07.009Khan A., Khan M. I., Iqbal Z., et al. An optimized and validated RP-HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-trans-Retinol (Vitamin A) and α-Tocopherol (Vitamin E) in human serum: Comparison of different particulate reversed-phase HPLC columns / J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2010. Vol. 878. N 25. P. 2339 – 2347. DOI: 10.1016/j.jchromb.2010.07.009Craft N. E., Furr H. C. Chapter 2 — Methods for assessment of Vitamin A (Retinoids) and carotenoids / Laboratory Assessment of Vitamin Status / D. Harrington, Ed. — Elsevier Inc., 2019. P. 21 – 47. DOI: 10.1016/B978-0-12-813050-6.00002-4Craft N. E., Furr H. C. Chapter 2 — Methods for assessment of Vitamin A (Retinoids) and carotenoids / Laboratory Assessment of Vitamin Status / D. Harrington, Ed. — Elsevier Inc., 2019. P. 21 – 47. DOI: 10.1016/B978-0-12-813050-6.00002-4de la Cruz Quiroz R., Chotyakul N., Saraiva J. A., et al. Retention of Ascorbic Acid, Retinol, β-Carotene, and α-Tocopherol in Milk Subjected to Pressure-Assisted Thermal Processing (PATP) / Food Eng. Rev. 2020. Vol. 13. P. 634 – 641. DOI: 10.1007/s12393-020-09242-zde la Cruz Quiroz R., Chotyakul N., Saraiva J. A., et al. Retention of Ascorbic Acid, Retinol, β-Carotene, and α-Tocopherol in Milk Subjected to Pressure-Assisted Thermal Processing (PATP) / Food Eng. Rev. 2020. Vol. 13. P. 634 – 641. DOI: 10.1007/s12393-020-09242-zГОСТ Р 54635–2011. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина A. — М.: Стандартинформ, 2013. — 15 с.State Standard GOST R 54635–2011. Functional food products. Method for determining vitamin A. — Moscow: Standartinform, 2013. — 15 p. [in Russian].ОФС.1.2.3.0017.15. Методы количественного определения витаминов / Государственная фармакопея РФ XIV издания.OFS.1.2.3.0017.15. Methods for the quantitative determination of vitamins / State Pharmacopoeia of Russian Federation XIV Edition [in Russian].Temova Rakusa Z., Srecnik E., Roskar R. Novel HPLC-UV method for simultaneous determination of fat-soluble vitamins and coenzyme Q10 in medicines and supplements / Acta Chim. Slov. 2017. Vol. 64. P. 523 – 529. DOI: 10.17344/acsi.2016.2856Temova Rakusa Z., Srecnik E., Roskar R. Novel HPLC-UV method for simultaneous determination of fat-soluble vitamins and coenzyme Q10 in medicines and supplements / Acta Chim. Slov. 2017. Vol. 64. P. 523 – 529. DOI: 10.17344/acsi.2016.2856ГОСТ 32043–2012. Премиксы. Методы определения витаминов A, D, E. — М.: Стандартинформ, 2012. — 16 с.Interstate Standard GOST 32043–2012. Premixes. Methods for determining vitamins A, D, E. — Moscow: Standartinform, 2012. — 16 p. [in Russian].ГОСТ Р 54950–2012 (ИСО 14565:2000). Корма для животных. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. — М.: Стандартинформ, 2012. — 15 с.State Standard GOST R 54950–2012 (ISO 14565:2000) Animal feed. Determination of vitamin A content by high-performance liquid chromatography. — Moscow: Standartinform, 2012. — 15 p. [in Russian].ГОСТ EN 12822–2014. Продукты пищевые. Определение содержания витамина Е (альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. — М.: Стандартинформ, 2014. — 25 с.State Standard GOST EN 12822–2014. Food products. Determination of vitamin E content (alpha-, beta-, gamma- and delta-tocopherols) by high-performance liquid chromatography. — Moscow: Standartinform. 2014. — 25 p. [in Russian].ГОСТ Р 54949–2012 (ИСО 6867:2000). Корма для животных. Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. — М.: Стандартинформ, 2012. — 11 с.GOST R 54949–2012 (ISO 6867:2000). Animal feed. Determination of vitamin E content by high-performance liquid chromatography. —- Moscow: Standartinform, 2012. — 11 p. [in Russian].Тимофеев Н. П. Содержание витаминов в листьях левзеи сафлоровидной (на фоне экдистероидов) / Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. Т. 3. — М.: ВНИИССОК, 2017. С. 72 – 74.Timofeev N. P. Content of vitamins in leaves of Leuzea carthamoides (against ecdysteroids) / New and non-traditional plants and prospects for their use. Vol. 3. — Moscow: VNIISSOK, 2017. P. 72 – 74 [in Russian].Востоков В. М., Карташев В. Р. Хроматографический контроль биохимической активности жирорастворимых витаминов (A, D, E) в пищевой и кормовой продукции / Изв. вузов. Серия: Химия и химическая технология. 2006. Т. 49. № 4. С. 115 – 118.Vostokov V. M., Kartashev V. R. Chromatographic control of the biochemical activity of fat-soluble vitamins (A, D, E) in food and feed products / Izv. Vuzov. Ser. Khimiya Khim. Tekhnol. 2006. Vol. 49. N 4. P. 115 – 118 [in Russian].Белозерцева Е. А., Финкельштейн Е. И., Еремин С. В., Швец В. И. Новый подход к ВЭЖХ-анализу жидких витаминсодержащих лекарственных форм / Вестн. МИТХТ им. М. В. Ломоносова. 2012. Т. 7. № 2. С. 58 – 64.Belozertseva E. A., Finkelshtein E. I., Eremin S. V., Shvets V. I. A new approach to HPLC analysis of liquid vitamin-containing dosage forms / Vestn. MITKhT im. M. V. Lomonosova. 2012. Vol. 7. N 2. P. 58 – 64 [in Russian].Самусева К. Р. Контроль содержания жирорастворимых витаминов в косметических кремах / Тезисы докладов VIII Международной научно-практической конференции студентов и магистрантов «Молодость. Интеллект. Инициатива». Витебск, 2020. С. 97 – 98.Samuseva K. R. Control of the content of fat-soluble vitamins in cosmetic creams / Proc. of VIII Int. Scientific-practical Conference «Youth. Intelligence. Initiative». Vitebsk, 2020. P. 97 – 98 [in Russian].Тринеева О. В., Сафонова Е. Ф., Сливкин А. И. Определение витаминов А и Е в тонком слое при совместном присутствии / Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2015. Т. 3. С. 129 – 134.Trineeva O. V., Safonova E. F., Slivkin A. I. Determination of vitamins A and E in a thin layer when present together / Vestn. VGU. Ser. Khim. Biol. Farm. 2015. Vol. 3. P. 129 – 134 [in Russian].Романов О. Е., Будинов С. В., Штыков С. Н. Тонкослойная хроматография витаминов А и Е на силикагеле / Сорбционные и хроматографические процессы. 2014. Т. 14. № 4. С. 563 – 571.Romanov O. E., Budinov S. V., Shtykov S. N. Thin layer chromatography of vitamins A and E on silica gel / Sorb. Khromatogr. Prots. 2014. Vol. 14. N 4. P. 563 – 571 [in Russian].Государственная фармакопея СССР. XI издание. — М.: Медицина, 1987. — 324 с.State Pharmacopoeia of the USSR. XI edition. — Moscow: Meditsyna, 1987. — 324 p. [in Russian].Фадейкина И. Н., Пеункова Е. С., Зуев Б. К. Определение витамина Е (ацетата α-токоферола) на поверхности кожи человека методом ИК-Фурье спектрометрии и изучение некоторых аспектов его трансдермального переноса / Журн. аналит. химии. 2021. Т. 76. № 2. С. 130 – 134. DOI: 10.31857/S0044450221020080Fadeikina I. N., Peunkova E. S., Zuev B. K. Determination of vitamin E (α-tocopherol acetate) on the surface of human skin by IR Fourier-transform spectrometry and study of some aspects of its transdermal transfer / J. Anal, Chem. 2021. Vol. 76. N 2. P. 191 – 195 [in Russian]. DOI: 10.1134/S1061934821020088Финкельштейн Е. И., Рудакова И. П., Самылина И. А. Методы количественного определения витаминов в лекарственных формах / Фармация. 2007. Т. 4. С. 45 – 48.Finkelshtein E. I., Rudakova I. P., Samylina I. A. Methods for the quantitative determination of vitamins in dosage forms / Farmatsiya. 2007. Vol. 4. P. 45 – 48 [in Russian].Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания. — М.: Институт фармакопеи и стандартизации в сфере обращения лекарственных средств, 2018. — 704 с.State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIV edition. — Moscow, 2018. — 704 p. [in Russian].Михеева Е. В., Анисимова Л. С. Физико-химические методы определения витамина Е в различных объектах (обзор) / Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2005. Т. 71. № 2. С. 3 – 9.Mikheeva E. V., Anisimova L. S. Physicochemical methods for determining vitamin E in various objects (review) / Industr. Lab. Mater. Diagn. 2005. Vol. 71. N 2. P. 3 – 9 [in Russian].Кульнева Ю. Ю. Оптимизация определения жирорастворимых витаминов / Материалы VI (63-й) ежегодной научно-практической конференции «Университетская наука — региону» Северо-Кавказского федерального университета. — Ставрополь, 2018. С. 383 – 387.Kulneva Yu. Yu. Optimization of determination of fat-soluble vitamins / Proc. of VI (63rd) Annual Scientific and Practical Conference «University science for the region» of the North Caucasus Federal University. — Stavropol, 2018. P. 383 – 387 [in Russian].Kazakevich Y. V., LoBrutto R., Eds. HPLC for Pharmaceutical Scientists. — John Wiley & Sons Inc., 2007. — 1104 p. DOI: 10.1002/0470087951Kazakevich Y. V., LoBrutto R., Eds. HPLC for Pharmaceutical Scientists. — John Wiley & Sons Inc., 2007. — 1104 p. DOI: 10.1002/0470087951Gogal’ová Z., Kahle V., Šesták J. An improved design of the fused silica capillary flow cell for absorbance detection in microcolumn liquid chromatography / Anal. Chim. Acta. 2023. Vol. 1238. 340637. DOI: 10.1016/j.aca.2022.340637Gogal’ová Z., Kahle V., Šesták J. An improved design of the fused silica capillary flow cell for absorbance detection in microcolumn liquid chromatography / Anal. Chim. Acta. 2023. Vol. 1238. 340637. DOI: 10.1016/j.aca.2022.340637Алексеева А. С., Шемерянкина Т. Б., Лякина М. Н. и др. Анализ витамина А в поливитаминных препаратах / Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2021. Т. 11. № 3. С. 174 – 184. DOI: 10.30895/1991-2919-2021-11-174-184Alekseeva A. S., Shemeryankina T. B., Lyakina M. N., et al. Analysis of Vitamin A in Multivitamin products / Vedom. Nauch. Tsentra Ékspert. Sredstv Med. Prim. 2021. Vol. 11. N 3. P. 174 – 184 [in Russian]. DOI: 10.30895/1991-2919-2021-11-174-184Костарной А. В., Голубицкий Г. Б., Басова Е. М. и др. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа многокомпонентных лекарственных препаратов / Журн. аналит. химии. 2008. Т. 63. № 6. С. 566 – 580.Kostarnoi A. V., Golubitskii G. B., Basova E. M., et al. High-performance liquid chromatography in the analysis of multicomponent / J. Anal. Chem. 2008. Vol. 63. N 6. P. 516 – 529. DOI: 10.1134/S1061934808060026ГОСТ Р 54634–2011. Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина E. — М.: Стандартинформ, 2013. — 15 с.State Standard GOST R 54634–2011. Functional food products. Method for determining vitamin E. — Moscow: Standartinform, 2013. — 15 p. [in Russian].Rimkus G. G., Schubert M., Morgan D., Jungjohann S. Rapid direct analysis of retinyl palmitate (vitamin A) in fortified vegetable oils by HPLC-FLD / Food Addit. Contam.: Part A. 2022. Vol. 39. N 1. P. 24 – 34. DOI: 10.1080/19440049.2021.1977854Rimkus G. G., Schubert M., Morgan D., Jungjohann S. Rapid direct analysis of retinyl palmitate (vitamin A) in fortified vegetable oils by HPLC-FLD / Food Addit. Contam.: Part A. 2022. Vol. 39. N 1. P. 24 – 34. DOI: 10.1080/19440049.2021.1977854Воронцова О. С., Маркова К. В. Способ определения витамина A (ретинола) в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Сб. науч. трудов Международной научно-практической конференции «Здоровье и окружающая среда». — Минск, 2016. С. 227 – 229.Vorontsova O. S., Markova K. V. A method for determining vitamin A (retinol) in food products using high-performance liquid chromatography / Proc. of the International Scientific and Practical Conference «Health and the Environment». — Minsk, 2016. P. 227 – 229 [in Russian].Воробьева О. А. Особенности пробоподготовки при проведении ОФ-ВЭЖХ анализа токолов в масле семян тыквы / Фундаментальные и прикладные исследования: проблемы и результаты. 2016. Т. 24. С. 147 – 151.Vorobyova O. A. Features of sample preparation during RP-HPLC analysis of tocols in pumpkin seed oil / Fund. Prikl. Issl. Probl. Result. 2016. Vol. 24. P. 147 – 151 [in Russian].Рудаков О. Б., Хорохордина Е. А., Рудакова Л. В., Грошев Е. Н. Ацетонитрил-уникальный растворитель для жидкостной хроматографии и экстракции / Вестник Воронежского гос. ун-та. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2015. Т. 3. С. 41 – 46.Rudakov O. B., Khorokhordina E. A., Rudakova L. V., Groshev E. N. Acetonitrile is a unique solvent for liquid chromatography and extraction / Vestn. VGU. Ser. Khim. Biol. Farm. 2015. Vol. 3. P. 41 – 46 [in Russian].Садек П. Растворители для ВЭЖХ. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2006. — 704 с.Sadek P. C. The HPLC solvent guide. — NY: Wiley, 1996. — 346 p.Филимонов В. Н., Замуруев О. В. Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентной подвижной фазы для хроматографического разделения смеси жирорастворимых витаминов методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии / Журн. физ. химии. 2001. Т. 75. ¹ 12. С. 2226 – 2232.Filimonov V. N., Zamuruev O. V. Multiparametric optimization of the composition of a three-component mobile phase for separating a mixture of fat-soluble vitamins by normal-phase high-performance liquid chromatography / Russ. J. Phys. Chem. A. 2001. Vol. 75. N 12. P. 2046 – 2052.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.