zldmЗаводская лаборатория. Диагностика материаловIndustrial laboratory. Diagnostics of materials1028-68612588-0187ООО «Издательство «ТЕСТ-ЗЛ»10.26896/1028-6861-2026-92-7-13-18zldm-2882Research ArticleАНАЛИЗ ВЕЩЕСТВАSUBSTANCES ANALYSISРазработка и валидация ВЭЖХ-методики определения примеси свободного эмтанзина в составе терапевтического конъюгата на основе рекомбинантной адресной молекулы белковой природыDevelopment and validation of a HPLC method for the determination of free emtansine impurity in a therapeutic conjugate based on a recombinant targeted protein moleculeПрачА. А.PrachA. A.

Анастасия Александровна Прач

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30

634009, г. Томск, Кооперативный пер., д. 5

Anastasia A. Prach

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050

5, Kooperativny per., Tomsk, 634009

nastya.prach@mail.ruЛарькинаМ. С.LarkinaM. S.

Мария Сергеевна Ларькина

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2

Maria S. Larkina

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

АвдееваЕ. Ю.AvdeevaE. Yu.

Елена Юрьевна Авдеева

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2

Elena Yu. Avdeeva

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

КадыроваТ. В.KadyrovaT. V.

Татьяна Владимировна Кадырова

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2

Tatiana V. Kadyrova

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

КривощековС. В.KrivoshchekovS. V.

Сергей Владимирович Кривощеков

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2

Sergey V. Krivoshchekov

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

БелоусовМ. В.BelousovM. V.

Михаил Валерьевич Белоусов

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30

634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2

Mikhail V. Belousov

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050

2, Moskovsky trakt, Tomsk, 634050

ПлотниковЕ. В.PlotnikovE. V.

Евгений Владимирович Плотников

634050, г. Томск, просп. Ленина, д. 30

Evgeny V. Plotnikov

30, prosp. Lenina, Tomsk, 634050

Национальный исследовательский Томский политехнический университет; НИИ онкологии Томского НИМЦРоссияNational Research Tomsk Polytechnic University; Scientific Research Institute of Oncology, Tomsk Scientific Research CenterRussian FederationНациональный исследовательский Томский политехнический университет; Сибирский государственный медицинский университетРоссияNational Research Tomsk Polytechnic University; Siberian State Medical UniversityRussian FederationСибирский государственный медицинский университетРоссияSiberian State Medical UniversityRussian FederationНациональный исследовательский Томский политехнический университетРоссияNational Research Tomsk Polytechnic UniversityRussian Federation2026260720269271318Copyright © Прач А.А., Ларькина М.С., Авдеева Е.Ю., Кадырова Т.В., Кривощеков С.В., Белоусов М.В., Плотников Е.В., 20262026Прач А.А., Ларькина М.С., Авдеева Е.Ю., Кадырова Т.В., Кривощеков С.В., Белоусов М.В., Плотников Е.В.Prach A.A., Larkina M.S., Avdeeva E.Y., Kadyrova T.V., Krivoshchekov S.V., Belousov M.V., Plotnikov E.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.zldm.ru/jour/article/view/2882

Для снижения неблагоприятного воздействия при системном введении цитотоксических агентов, применяемых в терапии онкологических заболеваний, на здоровые ткани используют конъюгаты антитело – лекарство (ADC), которые обеспечивают адресную доставку препаратов в опухолевые ткани. Альтернативой препаратам на основе антител являются конъюгаты цитотоксических агентов и таргетных носителей с меньшим размером молекул, в частности белка DARPin G3, обладающего высокой стабильностью и специфичностью к HER2-положительным раковым клеткам. Объектом исследования был конъюгат таргетного белка, специфичного к рецептору HER2, слитого с альбуминсвязывающим доменом (DARPin G3-ABD), и цитотоксического агента эмтанзина (DM1), находящийся на стадии доклинических испытаний. Из-за риска накопления неконъюгированного эмтанзина, который может вызывать нецелевую токсичность, необходимо контролировать его содержание в препарате. Для этой цели разработан упрощенный и доступный способ определения свободного эмтанзина методом ВЭЖХ, обеспечивающий оперативный контроль качества терапевтических конъюгатов. В ходе пробоподготовки проводили коагуляцию конъюгата в этаноле, затем анализировали супернатант методом микроколоночной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием на колонке ProntoSIL-120-5-C18 при выбранных условиях. Предложенная пробоподготовка позволяет проводить хроматографический анализ без использования дорогостоящих колонок для разделения конъюгата и свободного эмтанзина. Разработанная методика определения примеси свободного эмтанзина в составе терапевтического конъюгата DARPin G3-ABD-DM1 валидирована по ключевым показателям, оценены ее метрологические характеристики. Методика апробирована при анализе лабораторных образцов конъюгата: содержание свободного эмтанзина в различных партиях не превышало 0,2 %.

To reduce the adverse effects of cytotoxic agents used in cancer therapy on healthy tissues, antibody – drug conjugates are used, which provide targeted drug delivery to tumor tissues. An alternative to antibody-based drugs are conjugates of cytotoxic agents and targeted carriers with smaller molecule sizes, in particular, the DARPin G3 protein, which has high stability and specificity for HER2-positive cancer cells. The object of the study was a conjugate of a targeted protein specific to the HER2 receptor fused to the albumin-binding domain (DARPin G3-ABD) and the cytotoxic agent emtansine (DM1), which is currently in preclinical trials. Due to the risk of accumulation of unconjugated emtansine, which can cause untargeted toxicity, it is necessary to monitor its content. For this purpose, a simplified and affordable technique for the determination of free emtansine by HPLC has been developed, providing operational quality control of therapeutic conjugates. During sample preparation, the conjugate was coagulated in ethanol, then the supernatant was analyzed by micro column chromatography with UV detection on a ProntoSIL-120-5-C18 column under selected conditions. The proposed sample preparation allows for chromatographic analysis without using expensive columns to separate conjugate and free emtansine. The developed technique for determining the impurity of free emtansine in the composition of the therapeutic conjugate DARPin G3-ABD-DM1 has been validated by key indicators, and its metrological characteristics have been evaluated. The technique was tested in the analysis of laboratory conjugate samples: the content of free emtansine did not exceed 0.2%.

ВЭЖХвалидацияDARPin G3эмтанзинтерапевтический конъюгатHPLCvalidationDARPin G3emtansinetherapeutic conjugateReferencesBodenko V. V., Larkina M. S., Prach A. A., et al. Molecular targets for metastasis-directed therapy in malignant tumors / Bull. Siberian Med. 2024. Vol. 23. No. 2. P. 101 – 113 [in Russian]. DOI: 10.20538/1682-0363-2024-2-101-113Bodenko V. V., Larkina M. S., Prach A. A., et al. Molecular targets for metastasis-directed therapy in malignant tumors / Bull. Siberian Med. 2024. Vol. 23. No. 2. P. 101 – 113 [in Russian]. DOI: 10.20538/1682-0363-2024-2-101-113Liu K., Li M., Li Y., et al. A review of the clinical efficacy of FDA-approved antibody-drug conjugates in human cancers / Mol. Cancer. 2024. Vol. 23. No. 1. 62. DOI: 10.1186/s12943-024-01963-7Liu K., Li M., Li Y., et al. A review of the clinical efficacy of FDA-approved antibody-drug conjugates in human cancers / Mol. Cancer. 2024. Vol. 23. No. 1. 62. DOI: 10.1186/s12943-024-01963-7Ballantyne A., Dhillon S. Trastuzumab emtansine: first global approval / Drugs. 2013. Vol. 73. No. 7. P. 755 – 765. DOI: 10.1007/s40265-013-0050-2Ballantyne A., Dhillon S. Trastuzumab emtansine: first global approval / Drugs. 2013. Vol. 73. No. 7. P. 755 – 765. DOI: 10.1007/s40265-013-0050-2Lewis Phillips G. D., Li G., Dugger D. L., et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody – cytotoxic drug conjugate / Cancer Res. 2008. Vol. 68. No. 22. P. 9280 – 9290. DOI: 10.1158/0008-5472.can-08-1776Lewis Phillips G. D., Li G., Dugger D. L., et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody – cytotoxic drug conjugate / Cancer Res. 2008. Vol. 68. No. 22. P. 9280 – 9290. DOI: 10.1158/0008-5472.can-08-1776Akaiwa M., Dugal-Tessier J., Mendelsohn B. A. Antibody-drug conjugate payloads; study of auristatin derivatives / Chem. Pharm. Bull. 2020. Vol. 68. No. 3. P. 201 – 211. DOI: 10.1248/cpb.c19-00853Akaiwa M., Dugal-Tessier J., Mendelsohn B. A. Antibody-drug conjugate payloads; study of auristatin derivatives / Chem. Pharm. Bull. 2020. Vol. 68. No. 3. P. 201 – 211. DOI: 10.1248/cpb.c19-00853Ponziani S., Di Vittorio G., Pitari G., et al. Antibody-drug conjugates: the new frontier of chemotherapy / Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. No. 15. 5510. DOI: 10.3390/ijms21155510Ponziani S., Di Vittorio G., Pitari G., et al. Antibody-drug conjugates: the new frontier of chemotherapy / Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. No. 15. 5510. DOI: 10.3390/ijms21155510Boos A., Most J., Cahuzac H., et al. Antibody-vincristine conjugates as potent anticancer therapeutic agents / J. Med. Chem. 2024. Vol. 68. No. 1. P. 695 – 705. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c02425Boos A., Most J., Cahuzac H., et al. Antibody-vincristine conjugates as potent anticancer therapeutic agents / J. Med. Chem. 2024. Vol. 68. No. 1. P. 695 – 705. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c02425Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., et al. Comparative preclinical evaluation of HYNIC-modified designed ankyrin repeat proteins G3 for the 99mTc-based imaging of HER2-expressing malignant tumors / Mol. Pharmaceutics. 2024. Vol. 21. No. 4. P. 1919 – 1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., et al. Comparative preclinical evaluation of HYNIC-modified designed ankyrin repeat proteins G3 for the 99mTc-based imaging of HER2-expressing malignant tumors / Mol. Pharmaceutics. 2024. Vol. 21. No. 4. P. 1919 – 1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173Larkina M., Varvashenya R., Prach A., et al. The position of 99mTc-HYNIC and the molecular design of the DARPin G3 constructs influence the selection of an imaging tracer to detect expression in HER2-expressing tumors / J. Radioanal. Nucl. Chem. 2026. Vol. 335. P. 1945 – 1959. DOI: 10.1007/s10967-026-10739-wLarkina M., Varvashenya R., Prach A., et al. The position of 99mTc-HYNIC and the molecular design of the DARPin G3 constructs influence the selection of an imaging tracer to detect expression in HER2-expressing tumors / J. Radioanal. Nucl. Chem. 2026. Vol. 335. P. 1945 – 1959. DOI: 10.1007/s10967-026-10739-wZelchan R., Chernov V., Medvedeva A., et al. Phase I clinical evaluation of designed ankyrin repeat protein [99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 for visualization of EpCAM-expressing lung cancer / Cancers (Basel). 2024. Vol. 16. No. 16. 2815. DOI: 10.3390/cancers16162815Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., et al. Phase I clinical evaluation of designed ankyrin repeat protein [99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 for visualization of EpCAM-expressing lung cancer / Cancers (Basel). 2024. Vol. 16. No. 16. 2815. DOI: 10.3390/cancers16162815Prach A. A., Bodenko V. V., Fominykh A. The effect of the ABD position on the targeted properties of a new bivalent therapeutic conjugate based on DARPin G3 / Proc. of the XXI Int. Conference of Students, Postgraduates and Young Scientists «Prospects for the development of fundamental sciences». Tomsk, 2024, April 23 – 26. Vol. 4. P. 112 – 114 [in Russian].Prach A. A., Bodenko V. V., Fominykh A. The effect of the ABD position on the targeted properties of a new bivalent therapeutic conjugate based on DARPin G3 / Proc. of the XXI Int. Conference of Students, Postgraduates and Young Scientists «Prospects for the development of fundamental sciences». Tomsk, 2024, April 23 – 26. Vol. 4. P. 112 – 114 [in Russian].de Mel N., Mulagapati S. H. R., Cao M., Liu D. A method to directly analyze free-drug-related species in antibody – drug conjugates without sample preparation / J. Chromatogr. B. 2019. Vol. 1116. P. 51 – 59. DOI: 10.1016/j.jchromb.2019.04.012de Mel N., Mulagapati S. H. R., Cao M., Liu D. A method to directly analyze free-drug-related species in antibody – drug conjugates without sample preparation / J. Chromatogr. B. 2019. Vol. 1116. P. 51 – 59. DOI: 10.1016/j.jchromb.2019.04.012Goyon A., Sciascera L., Clarke A., et al. Extending the limits of size exclusion chromatography: Simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates / J. Chromatogr. A. 2018. Vol. 1539. P. 19 – 29. DOI: 10.1016/j.chroma.2018.01.039Goyon A., Sciascera L., Clarke A., et al. Extending the limits of size exclusion chromatography: Simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates / J. Chromatogr. A. 2018. Vol. 1539. P. 19 – 29. DOI: 10.1016/j.chroma.2018.01.039Lovato G., Ciriolo L., Perrucci M., et al. HPLC-DAD validated method for DM4 and its metabolite S-Me-DM4 quantification in biological matrix for clinical and pharmaceutical applications / J. Pharm. Biomed. Anal. 2023. Vol. 235. 115642. DOI: 10.1016/j.jpba.2023.115642Lovato G., Ciriolo L., Perrucci M., et al. HPLC-DAD validated method for DM4 and its metabolite S-Me-DM4 quantification in biological matrix for clinical and pharmaceutical applications / J. Pharm. Biomed. Anal. 2023. Vol. 235. 115642. DOI: 10.1016/j.jpba.2023.115642Deyev S. M., Oroujeni M., Garousi J., et al. Preclinical evaluation of HER2-targeting DARPin G3: impact of albumin-binding domain (ABD) fusion / Int. J. Mol. Sci. 2024. Vol. 25. No. 8. 4246. DOI: 10.3390/ijms25084246Deyev S. M., Oroujeni M., Garousi J., et al. Preclinical evaluation of HER2-targeting DARPin G3: impact of albumin-binding domain (ABD) fusion / Int. J. Mol. Sci. 2024. Vol. 25. No. 8. 4246. DOI: 10.3390/ijms25084246Prach A. A., Larkina M. S., Krivoshchekov S. V., et al. Evaluation of the possibility of using UV spectrophotometry for standardization of a new targeted conjugate based on a recombinant fusion protein and emtansine / Vestn. VGU. Ser. Khim. Biol. Farm. 2026. No. 1. P. 97 – 104 [in Russian].Prach A. A., Larkina M. S., Krivoshchekov S. V., et al. Evaluation of the possibility of using UV spectrophotometry for standardization of a new targeted conjugate based on a recombinant fusion protein and emtansine / Vestn. VGU. Ser. Khim. Biol. Farm. 2026. No. 1. P. 97 – 104 [in Russian].Mak S. Y., Chen S., Fong W. J., et al. A simple and highly sensitive LC-MS workflow for characterization and quantification of ADC cleavable payloads / Sci. Rep. 2024. Vol. 14. No. 1. 11018. DOI: 10.1038/s41598-024-61522-4Mak S. Y., Chen S., Fong W. J., et al. A simple and highly sensitive LC-MS workflow for characterization and quantification of ADC cleavable payloads / Sci. Rep. 2024. Vol. 14. No. 1. 11018. DOI: 10.1038/s41598-024-61522-4Bechtold-Peters K., Ruggiero A., Vriezen N., et al. CMC regulatory considerations for antibody – drug conjugates / J. Pharm. Sci. 2023. Vol. 112. No. 12. P. 2965 – 2980. DOI: 10.1016/j.xphs.2023.09.007Bechtold-Peters K., Ruggiero A., Vriezen N., et al. CMC regulatory considerations for antibody – drug conjugates / J. Pharm. Sci. 2023. Vol. 112. No. 12. P. 2965 – 2980. DOI: 10.1016/j.xphs.2023.09.007

The authors declare that there are no conflicts of interest present.