Определение реакционной способности к ферментативному гидролизу целлюлозосодержащих субстратов

В связи с возрастающим научным интересом к разработке эффективных способов трансформации различных источников целлюлозосодержащего сырья в ферментабельные сахара возникла необходимость разработки универсальной методики определения реакционной способности к ферментативному гидролизу целлюлозосодержащих субстратов. Практическая значимость такой методики заключается в максимальной доступности для лабораторий опытно-промышленных производств, занимающихся апробированием и масштабированием биотехнологических процессов. Предложенная в данной работе методика полностью соответствует предъявляемым современным требованиям и основана на спектрофотометрическом и хроматографическом определении редуцирующих веществ в ферментативных гидролизатах предварительно подготовленных субстратов, при этом биокатализ осуществлялся композицией доступных ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Брюзайм-BGX». Дополнительно данная методика предполагает гравиметрический анализ твердых осадков после гидролиза субстратов. Как правило, для контроля можно ферментировать целлюлозосодержащее сырье без предварительной обработки, но можно использовать и коммерческие виды целлюлозы. Установлено, что применение методики позволило оперативно и с высоким качеством оценить реакционную способность к ферментативному гидролизу ряда выбранных субстратов. В отличие от обсуждаемых в литературе методов ферментативного гидролиза для оценки эффективности ферментов, данная методика позволяет с использованием одной и той же композиции ферментных препаратов расположить в ряд по убыванию реакционной способности к гидролизу выбранные виды целлюлозосодержащего сырья, а также показать зависимость исследуемой способности субстратов от способа предварительной химической обработки. Полученные результаты могут быть представлены в виде зависимости концентрации (выхода) редуцирующих веществ от продолжительности ферментативного гидролиза субстрата, а также в виде рассчитанных значений скорости гидролиза, конечных выходов редуцирующих веществ, в том числе и пентоз, содержания глюкозной составляющей редуцирующих веществ и убыли по массе. Методика была многократно апробирована при анализе широкого круга целлюлозосодержащих субстратов: получены достоверные результаты оценки их реакционной способности. Методика также позволяет прогнозировать результаты масштабирования ферментативного гидролиза, в том числе и в водной среде, при получении питательных сред для микробиологического синтеза.

целлюлозосодержащий субстрат, методика, реакционная способность, ферментативный гидролиз, редуцирующие вещества, глюкоза, ксилоза, спектрофотометрия, ВЭЖХ

1. Chen B., Zhao B., Li M., et al. Fractionation of rapeseed straw by hydrothermal/dilute acid pretreatment combined with alkali post-treatment for improving its enzymatic hydrolysis / Biores. Technol. 2017. Vol. 225. P. 127 – 133.

2. Sills D. L., Gossett J. M. Using FTIR to predict saccharification from enzymatic hydrolysis of alkali-pretreated biomasses / Biotechnol. Bioeng. 2012. Vol. 109. N 2. P. 353 – 362.

3. Alvira P., Tomбs-Pejу E., Ballesteros M., et al. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review / Biores. Technol. 2010. Vol. 101. N 13. P. 4851 – 4861.

4. Li K., Wan J., Wang X., et al. Comparison of dilute acid and alkali pretreatments in production of fermentable sugars from bamboo: Effect of Tween 80 / Industrial Crops and Products. 2016. Vol. 83. P. 414 – 422.

5. Sun S., Sun S., Cao X., et al. The role of pretreatment in improving the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials / Biores. Technol. 2016. Vol. 199. P. 49 – 58.

6. Van Dyk J. S., Pletschke B. I. A review of lignocellulose bioconversion using enzymatic hydrolysis and synergistic cooperation between enzymes — factors affecting enzymes, conversion and synergy / Biotechnol. Adv. 2012. Vol. 30. N 6. P. 1458 – 1480.

7. Gama M. Bacterial NanoCellulose from Biotechnology to Bio-Economy. — N.Y.: Elsevier, 2016. — 240 p.

8. Sakovich G. V., Skiba E. A., Budaeva V. V., et al. Technological fundamentals of bacterial nanocellulose production from zero prime-cost feedstock / Doklady Biochemistry and Biophysics. 2017. Vol. 477. P. 357 – 359.

9. Барам Г. И. Развитие метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и его применение для решения комплексных аналитических задач: дис. ... докт. хим. наук. — Иркутск, 1997. — 56 с.

10. Оболенская А. В., Ельницкая З. П., Леонович А. А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. — М.: Экология, 1991. — 320 с.

11. ГОСТ 6840–78. Целлюлоза. Метод определения содержания альфа-целлюлозы. — М.: Изд-во стандартов, 1984. — 6 с.

12. ГОСТ 10820–75. Целлюлоза. Метод определения массовой доли пентозанов. — М.: ИПК Изд-во стандартов, 1975. — 7 с.

13. ГОСТ 18461–93. Целлюлоза. Метод определения содержания золы. — М.: ИПК Изд-во стандартов, 1995. — 8 с.

14. ГОСТ 25438–82. Целлюлоза для химической переработки. Методы определения характеристической вязкости. — М.: Изд-во стандартов, 1982. — 20 с.

15. Thygesen A., Oddershede J., Lilholt H., et al. On the determination of crystallinity and cellulose content in plant fibres / Cellulose. 2005. Vol. 12. N 6. P. 563 – 576.

16. Gusakov A. V., Kondratyeva E. G., Sinitsyn A. P. Comparison of two methods for assaying reducing sugars in the determination of carbohydrase activities / Int. J. Anal. Chem. 2011. Vol. 2011. P. 283658.

17. Вешняков В. А., Хабаров Ю. Г., Камакина Н. Д. Сравнение методов определения редуцирующих веществ: метод Бертрана, эбулиостатический и фотометрический / Химия растительного сырья. 2008. № 4. С. 47 – 50.

18. Федорова Г. А., Кожанова Л. А., Азарова И. Н. Применение микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии в медицине. Часть 2 / Вестник восстановительной медицины. 2008. № 2(24). С. 47 – 50.

19. Budaeva V. V., Makarova E. I., Skiba E. A., et al. Enzymatic hydrolysis of the products of hydro-thermobaric processing of Miscanthus and oat hulls / Catalysis in Industry. 2013. Vol. 5. N 4. P. 335 – 341.

20. Makarova E. I., Budaeva V. V., Skiba E. A., et al. Enzymatic hydrolysis of celluloses obtained via the hydrothermal processing of Miscanthus and oat hulls / Catalysis in Industry. 2014. Vol. 6. N 1. P. 67 – 71.

21. Denisova M. N., Makarova E. I., Pavlov I. N., et al. Enzymatic hydrolysis of hydrotropic pulp at different substrate concentrations / Appl. Biochem. Biotechnol. 2016. Vol. 178. N 6. P. 1196 – 1206.

22. Tarabanko V. E., Kaygorodov K. L., Skiba E. A., et al. Processing pine wood into vanillin and glucose by sequential catalytic oxidation and enzymatic hydrolysis / J. Wood Chem. Technol. 2017. Vol. 37. N 1. P. 43 – 51.

23. Skiba E. A., Baibakova O. V., Budaeva V. V., et al. Pilot technology of ethanol production from oat hulls for subsequent conversion to ethylene / Chem. Eng. J. 2017. Vol. 329. P. 178 – 186.

24. Makarova E. I., Budaeva V. V., Kukhlenko A. A., et al. Enzyme kinetics of cellulose hydrolysis of miscanthus and oat hulls / 3 Biotech. 2017. Vol. 7. P. 317.

25. Будаева В. В., Макарова Е. И., Скиба Е. А. и др. Исследование кислотного и ферментативного гидролиза пеллет из рапсовой соломы / Ползуновский вестник. 2013. № 3. С. 173 – 179.

26. Щербакова Т. П., Удоратина Е. В., Макарова Е. И. и др. Влияние механохимических воздействий на эффективность ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья / Ползуновский вестник. 2013. № 3. С. 224 – 230.

27. De Bhowmick G., Sarmah A. K., Sen R. Lignocellulosic biorefinery as a model for sustainable development of biofuels and value added products / Biores. Technol. 2018. Vol. 247. P. 1144 – 1154.

28. Алешина Л. А., Люханова И. В., Будаева В. В. и др. Результаты рентгеноструктурного анализа недревесных целлюлоз / Ученые записки Петрозаводского гос. ун-та. 2011. № 8(121). С. 114 – 117.

29. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry / BioEnergy Res. 2012. Vol. 5. N 4. P. 1043 – 1066.