Разработка и валидация ВЭЖХ-методики определения примеси свободного эмтанзина в составе терапевтического конъюгата на основе рекомбинантной адресной молекулы белковой природы

Для снижения неблагоприятного воздействия при системном введении цитотоксических агентов, применяемых в терапии онкологических заболеваний, на здоровые ткани используют конъюгаты антитело – лекарство (ADC), которые обеспечивают адресную доставку препаратов в опухолевые ткани. Альтернативой препаратам на основе антител являются конъюгаты цитотоксических агентов и таргетных носителей с меньшим размером молекул, в частности белка DARPin G3, обладающего высокой стабильностью и специфичностью к HER2-положительным раковым клеткам. Объектом исследования был конъюгат таргетного белка, специфичного к рецептору HER2, слитого с альбуминсвязывающим доменом (DARPin G3-ABD), и цитотоксического агента эмтанзина (DM1), находящийся на стадии доклинических испытаний. Из-за риска накопления неконъюгированного эмтанзина, который может вызывать нецелевую токсичность, необходимо контролировать его содержание в препарате. Для этой цели разработан упрощенный и доступный способ определения свободного эмтанзина методом ВЭЖХ, обеспечивающий оперативный контроль качества терапевтических конъюгатов. В ходе пробоподготовки проводили коагуляцию конъюгата в этаноле, затем анализировали супернатант методом микроколоночной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием на колонке ProntoSIL-120-5-C18 при выбранных условиях. Предложенная пробоподготовка позволяет проводить хроматографический анализ без использования дорогостоящих колонок для разделения конъюгата и свободного эмтанзина. Разработанная методика определения примеси свободного эмтанзина в составе терапевтического конъюгата DARPin G3-ABD-DM1 валидирована по ключевым показателям, оценены ее метрологические характеристики. Методика апробирована при анализе лабораторных образцов конъюгата: содержание свободного эмтанзина в различных партиях не превышало 0,2 %.

1. Bodenko V. V., Larkina M. S., Prach A. A., et al. Molecular targets for metastasis-directed therapy in malignant tumors / Bull. Siberian Med. 2024. Vol. 23. No. 2. P. 101 – 113 [in Russian]. DOI: 10.20538/1682-0363-2024-2-101-113

2. Liu K., Li M., Li Y., et al. A review of the clinical efficacy of FDA-approved antibody-drug conjugates in human cancers / Mol. Cancer. 2024. Vol. 23. No. 1. 62. DOI: 10.1186/s12943-024-01963-7

3. Ballantyne A., Dhillon S. Trastuzumab emtansine: first global approval / Drugs. 2013. Vol. 73. No. 7. P. 755 – 765. DOI: 10.1007/s40265-013-0050-2

4. Lewis Phillips G. D., Li G., Dugger D. L., et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1, an antibody – cytotoxic drug conjugate / Cancer Res. 2008. Vol. 68. No. 22. P. 9280 – 9290. DOI: 10.1158/0008-5472.can-08-1776

5. Akaiwa M., Dugal-Tessier J., Mendelsohn B. A. Antibody-drug conjugate payloads; study of auristatin derivatives / Chem. Pharm. Bull. 2020. Vol. 68. No. 3. P. 201 – 211. DOI: 10.1248/cpb.c19-00853

6. Ponziani S., Di Vittorio G., Pitari G., et al. Antibody-drug conjugates: the new frontier of chemotherapy / Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. No. 15. 5510. DOI: 10.3390/ijms21155510

7. Boos A., Most J., Cahuzac H., et al. Antibody-vincristine conjugates as potent anticancer therapeutic agents / J. Med. Chem. 2024. Vol. 68. No. 1. P. 695 – 705. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c02425

8. Larkina M., Varvashenya R., Yuldasheva F., et al. Comparative preclinical evaluation of HYNIC-modified designed ankyrin repeat proteins G3 for the 99mTc-based imaging of HER2-expressing malignant tumors / Mol. Pharmaceutics. 2024. Vol. 21. No. 4. P. 1919 – 1932. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c01173

9. Larkina M., Varvashenya R., Prach A., et al. The position of 99mTc-HYNIC and the molecular design of the DARPin G3 constructs influence the selection of an imaging tracer to detect expression in HER2-expressing tumors / J. Radioanal. Nucl. Chem. 2026. Vol. 335. P. 1945 – 1959. DOI: 10.1007/s10967-026-10739-w

10. Zelchan R., Chernov V., Medvedeva A., et al. Phase I clinical evaluation of designed ankyrin repeat protein [99mTc]Tc(CO)3-(HE)3-Ec1 for visualization of EpCAM-expressing lung cancer / Cancers (Basel). 2024. Vol. 16. No. 16. 2815. DOI: 10.3390/cancers16162815

11. Prach A. A., Bodenko V. V., Fominykh A. The effect of the ABD position on the targeted properties of a new bivalent therapeutic conjugate based on DARPin G3 / Proc. of the XXI Int. Conference of Students, Postgraduates and Young Scientists «Prospects for the development of fundamental sciences». Tomsk, 2024, April 23 – 26. Vol. 4. P. 112 – 114 [in Russian].

12. de Mel N., Mulagapati S. H. R., Cao M., Liu D. A method to directly analyze free-drug-related species in antibody – drug conjugates without sample preparation / J. Chromatogr. B. 2019. Vol. 1116. P. 51 – 59. DOI: 10.1016/j.jchromb.2019.04.012

13. Goyon A., Sciascera L., Clarke A., et al. Extending the limits of size exclusion chromatography: Simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates / J. Chromatogr. A. 2018. Vol. 1539. P. 19 – 29. DOI: 10.1016/j.chroma.2018.01.039

14. Lovato G., Ciriolo L., Perrucci M., et al. HPLC-DAD validated method for DM4 and its metabolite S-Me-DM4 quantification in biological matrix for clinical and pharmaceutical applications / J. Pharm. Biomed. Anal. 2023. Vol. 235. 115642. DOI: 10.1016/j.jpba.2023.115642

15. Deyev S. M., Oroujeni M., Garousi J., et al. Preclinical evaluation of HER2-targeting DARPin G3: impact of albumin-binding domain (ABD) fusion / Int. J. Mol. Sci. 2024. Vol. 25. No. 8. 4246. DOI: 10.3390/ijms25084246

16. Prach A. A., Larkina M. S., Krivoshchekov S. V., et al. Evaluation of the possibility of using UV spectrophotometry for standardization of a new targeted conjugate based on a recombinant fusion protein and emtansine / Vestn. VGU. Ser. Khim. Biol. Farm. 2026. No. 1. P. 97 – 104 [in Russian].

17. Mak S. Y., Chen S., Fong W. J., et al. A simple and highly sensitive LC-MS workflow for characterization and quantification of ADC cleavable payloads / Sci. Rep. 2024. Vol. 14. No. 1. 11018. DOI: 10.1038/s41598-024-61522-4

18. Bechtold-Peters K., Ruggiero A., Vriezen N., et al. CMC regulatory considerations for antibody – drug conjugates / J. Pharm. Sci. 2023. Vol. 112. No. 12. P. 2965 – 2980. DOI: 10.1016/j.xphs.2023.09.007